研究简介
近日，医院胆道一科姜小清教授和思路迪转化医学部、生物信息部合作项目的科研成果在线发表于《HumanCell》，该研究采用胆囊癌患者来源的原代肿瘤细胞系（patient-derivedprimarycancercelllines,PDCs）和多组学分析揭示了胆囊癌的肿瘤内异质性（intra?tumorheterogeneity，ITH），同时发现同一患者来源PDCs的部分人类白细胞抗原（humanleukocyteantigen,HLA）基因表达存在差异，这不仅加深了对胆囊癌ITH的理解，还为后续研究ITH在胆囊癌中作用及其机制提供了良好的体外模型。
该科研合作是思路迪与国内多位临床专家基于患者来源原代肿瘤模型开展的系列合作之一。在继肝细胞癌ITH对药物治疗的影响（年，消化领域国际权威杂志Gastroenterology）、胆囊肉瘤中采用PDCs和全外显子组测序来确认靶向药物作用（年，Oncotarget）、肝细胞癌转移和预后生物标志物研究（年，OncologyReports）、食管鳞癌靶向药物敏感性生物标志物发现和验证研究（年，Nature杂志子刊NatureCommunications）和胆囊癌PDC模型的特征鉴定和药物敏感性分析（年，TranslationalCancerResearch）等多项原创性研究成果发表之后，又一项转化医学研究科研成果在线发表。
研究背景
胆囊癌(Gallbladdercarcinoma,GBC)是一种常见的恶性胆道肿瘤，其恶性程度高、治疗方法有限且效果不理想。目前手术是首选治疗方案，但大部分GBC患者在初诊时已不适合手术。晚期GBC患者预后极差，其五年生存率不足10%[1]。究其原因，对GBC发生发展机制缺乏深入理解严重阻碍了临床上建立更精确、更有效的治疗体系。已有研究报道了GBC的基因突变特征，初步揭示了潜在的治疗靶点及异常信号转导通路[2-3]。实际上，肿瘤精准医学的发展和提高不仅要明确基因突变，还要深入理解ITH特征及其作用。ITH被认为与肿瘤的适应性，以及与化疗、靶向治疗耐药性的产生有关[4]。然而，GBC中ITH的特征以及ITH对GBC进展的作用尚不清楚。
相比商业化细胞系，PDC离体培养传代的次数更少，更加贴近体内肿瘤真实情况，为新药研发和肿瘤标志物发现等肿瘤精准诊疗中的一系列基础和临床问题提供了独特的研究模型[5]。思路迪医院的临床专家已建立了规模庞大的PDC平台。截止至年，医院共建立了肝胆系统肿瘤PDCs近株，这是迄今为止全球最大的肝胆系统原代肿瘤细胞系库。此外，思路迪PDC建系也拓展到其他癌症，如肺癌、食管鳞癌、结直肠癌、卵巢癌、GBC和头颈部肿瘤等，目前已成功建系数百株，这为进一步开展肿瘤精准诊疗领域的转化医学研究奠定了坚实基础。据报道，在肺癌、卵巢癌和肝细胞癌等多种恶性肿瘤中PDC被用于肿瘤生物功能探索、药物敏感性和耐药性的评价及机制探索等研究[6-8]。更重要地，肝细胞癌和肝内胆管癌中ITH的研究表明，PDCs可用于评估ITH[8,9]。因此，本研究采用建立PDCs来探索GBC的ITH特征。
研究设计
基于医院胆道一科来源的新鲜GBC组织样本，本研究采用多区域取样的方式采集用于建立PDC的肿瘤组织，进一步分离、建立和鉴定PDCs。全外显子组测序(whole-exomesequencing,WES)和转录组测序(RNA-seq)分别被用于检测GBCPDCs的基因突变和转录水平，进一步分析GBC在基因突变和转录水平的ITH特征。本研究已获得医院伦理委员会的批准，入组本项目的每位患者均已签署知情同意书。
图1本研究设计
研究发现
1.GBC突变的ITH
本研究最终基于7例GBC患者的肿瘤组织样本一共成功构建和鉴定了38株PDCs，每例患者3到9株PDCs不等。提取每株PDC的DNA和RNA并分别进行WES和RNA-seq检测。基于不同PDCs所携带的突变，本研究为每一例患者构建了系统进化树并评估ITH。结果表明，GBC患者表现出不同的进化模式：不同患者的ITH存在较大差异，非主干突变（non-trunkmutation,不在所有样本中出现的突变）的比例从26.6%到59.4%（中位数38.3%）。此外，不同患者所携带的主干驱动突变（trunkmutation，所有样本中出现的突变）基因也存在差异（图2）。
图2胆囊癌突变的肿瘤内异质性
2.GBC的驱动突变基因
本研究一共发现24个可能的GBC驱动突变基因，绝大部分驱动基因携带的是主干突变。除了TP53、KMT2C、CDKN2A、ARID1B和ARID1A这5个基因，其余的驱动基因在不同患者之间表现为互斥关系，表明在肿瘤形成过程中不同患者的驱动事件存在差异（图3）。TP53是GBC中发生突变频率最高的基因，4例(4/7)患者携带TP53的主干突变。
图3胆囊癌驱动突变基因图谱
3.GBC的变异类型和特征（signature）
本研究分别针对主干和非主干突变进行了变异类型分布统计以及变异特征（mutationalsignature）分析。分析结果表明，无论是主干还是非主干突变，CT转换都是占比最高的变异类型（图4a）。CA转换和TC颠换分别是占比第2和第3的变异类型。CT转换在很多肿瘤都比较常见，而CA转换和TC颠换被认为是GBC的特征突变。图4b显示了主干和非主干突变的三碱基突变（突变位置碱基加上基因组上游和下游各一个碱基）分布。突变特征分析表明，主干突变的signature相对单一，占比最高的特征是signature1（与年龄相关）,而非主干突变的signature则更加复杂（图4c）。
图4胆囊癌变异类型以及signature分析
4.GBC拷贝数变异（CNV）的ITH
除了单碱基和短的插入缺失突变的异质性，本研究也分析了GBC患者CNV的肿瘤内异质性。总体而言，一共发现了23个拷贝数增加区域和22个拷贝数减少区域（图5）。4例患者的所有样本均携带CDKN2A缺失，另有6个致癌基因（PTK6、HRAS、NOTCH1、CCND1、FGFR3和TERT）至少在1例患者中发生了普遍的扩增。不同患者CNV的肿瘤内异质性表现出一定的差异。例如，患者携带的CNV绝大部分在所有样本都存在，而患者携带的CNV则表现出更高的异质性。
图5胆囊癌CNV的肿瘤内异质性
5.GBC基因表达的ITH
为了探索GBC基因表达的异质性，本研究将每一例患者的样本通过聚类分析分成两组，并用两组之间的差异表达基因数目来表征肿瘤基因表达的异质性。结果显示（图6），不同患者差异表达基因数目从到不等（中位数）。患者的R3和R5样本的表达谱与该患者的其余样本表现出较大差异，这一差异在突变层面也有体现。
图6胆囊癌基因表达谱的肿瘤内异质性
随后，本研究利用上述差异表达基因进行富集分析发现，这些基因富集在细胞迁移和细胞增殖等肿瘤相关生物过程。此外，本研究还发现患者和不同样本间的差异表达基因富集在了免疫应答和免疫系统处理等生物过程；进一步分析发现，与这些过程相关的主要是MHCclassII基因，比如HLADG(CD74)、HLA-DPA1、HLA-DRA、HLA-DRB1和HLA-DRB5等。一般认为，肿瘤细胞会表达MHCclassI基因（包括HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-E和HLA-F等），而MHCclassII基因在肿瘤细胞中通常不表达。虽然本研究的大部分样本MHCclassII基因不表达或低表达，但仍有部分样本这些基因的表达水平较高。例如，患者的R3和R5MHCclassII基因不表达，但是其余7例样本这些基因是表达的；患者和的所有样本均表达这些基因（图7a）。进一步分析发现，这些基因的表达水平与CIITA的表达高度相关（图7b）。
图7胆囊癌HLA基因表达的异质性
研究结论
本研究利用7例GBC患者肿瘤样本构建了38株PDCs，并运用WES和RNA-seq技术，在基因突变、拷贝数变化以及基因表达等层面进行了ITH探索，对理解GBC的发生发展过程提供了重要的理论基础，也为进一步研究GBC的ITH及其机制提供了体外模型。
参考文献
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[2]LiM,ZhangZ,LiX,etal.Whole-exomeandtargetedgenesequencingofgallbladdercarcinomaidentifiesrecurrentmutationsintheErbBpathway.Naturegenetics.,46(8):-.
[3]PandeyA,StawiskiEW,DurinckS,etal.IntegratedgenomicanalysisrevealsmutatedELF3asapotentialgallbladdercancervaccinecandidate.NatureCommun.,11(1):.
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[7]KreuzingerC,vonderDeckenI,WolfA,etal.Patient-derivedcelllinemodelsrevealedtherapeutictargetsandmolecularmechanismsunderlyingdiseaseprogressionofhighgradeserousovariancancer.CancerLett.;:1-12.
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[9]DongLQ,ShiY,MaLJ,YangLX,WangXY,ZhangS,WangZC,DuanM,ZhangZ,LiuLZetal:Spatialandtemporalclonalevolutionofintrahepaticcholangiocarcinoma.Journalofhepatology,69(1):89-98.
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