研究背景
在肝癌中，癌症相关成纤维细胞(CAF)的特性还有许多没有被研究明确。
本文研究了CAF在肝内胆管癌(ICC)中的功能作用，通过遗传谱系追踪、单细胞RNA测序和配体-受体分析发现肝星状细胞(HSC)是CAF的主要来源，而HSC来源的CAF是与肿瘤细胞相互作用的主要亚群。单细胞RNA测序将CAF分为炎性和生长因子富集(iCAF)和肌成纤维细胞(myCAF)亚群等，它们具有独特的配体-受体相互作用。
方法流程
研究结果
1.肝星状细胞来源的CAF是ICC中主要与肿瘤作用的亚群
小鼠肝内过表达致癌驱动子KRASG12D组合p19CRISPR(KRAS/p19)，或myr-AKT组合YAPSA(YAP/AKT)、NICD1(NICD/AKT)亦或FBXW7?f(FBXW7?f/AKT)，可产生组织病理学证实的细胞角蛋白7和19阳性ICC。利用TdTom标记HSC，发现在四个ICC的模型中，85％–95％Col1a1-GFP+CAF和85％–93%aSMA+CAF被标记，表明了CAF的HSC来源。scRNA-seq证实，在四个鼠ICC样本中91.9%±2.8%的泛CAF表达HSC的基因标记，并发现，在肿瘤微环境(TME)中HSC分化为更高活化水平的HSC-CAF。为确定HSC-CAF影响ICC的机制，通过CellPhoneDB分析了配体-受体相互作用：在鼠scRNA-seq样本中，CAF是与肿瘤细胞相互作用的主要细胞群，其中HSC-CAF的受配体对最多，同时，scRNA-seq人的ICC和肝门胆管癌(CCA)样本也证实了HSC-CAF的主导作用。此外还发现高panCAF标记以及高ACTA2mRNA表达与ICC患者的存活率降低和复发风险增加有关。
大多数CAF为HSC源性并与ICC肿瘤细胞紧密相互作用
为了将这些发现扩展到肝脏以外，接下来分析了KPC诱导的胰腺导管腺癌(PDAC)CAF的scRNA-seq数据，并确定了胰腺星状细胞(PSC)-CAF和间皮CAF亚群。PSC-CAF仅弱表达HSC标记，但它们与HSC-CAF共享大多星状细胞(SC)的基因标记。与ICC中的门脉成纤维细胞(PF-CAF)相似，PDAC中的间皮CAF高表达Msln、Upk1b、Upk3b和Gpm6a。这些数据表明胰腺和肝脏中的CAF个体发育相似，这与两个器官都含有SC的发现一致。
对比ICC和PDAC中的CAF
2.HSC源性的CAF促进ICC增长
为了阐明CAF在ICC中的功能，在小鼠模型中耗竭HSC-CAF或aSMA+CAF，可使CAF降低多达85％，同时纤维化程度降低。结果发现耗竭CAF会抑制ICC的发展。耗竭CAF的小鼠表现出显著降低的肿瘤细胞增殖，而肿瘤中凋亡却没有改变或减少。CAF耗竭和非耗竭的小鼠中都只有少量CD3+T细胞浸润，且两者淋巴细胞和髓细胞亚群没有显著差异。敲除调节CAF介导的炎症和肿瘤生长作用的核因子kB(NF-kB)，发现并没有减少ICC的生长。表明了CAF与肿瘤的直接作用触发了肿瘤细胞的增殖，这可能是CAF促进ICC生长的主要机制，而细胞凋亡、适应性免疫或炎症似乎仅起较小作用。
HSC来源的CAF促进ICC的发展和肿瘤细胞增殖
3.CAF不依赖于I型胶原蛋白促进肿瘤生长
接下来探索HSC来源的CAF促进ICC增长的介质。通过scRNA-seq分析了鼠CAF和人CAF，发现了富集炎症和生长因子的CAF(iCAF)、myCAF以及表达PF/间皮标记物的间皮CAF(mesCAF)亚群。iCAF表达高水平静息标记和低水平活化标记，并且富集炎症、生长因子、抗原呈递基因和通路。myCAF比iCAF表达更低的静息和更高的活化标记。使用Rgs5标记iCAF，Col1a1-GFP和SERPINF1标记myCAF，在原位证实了myCAF和iCAF亚群的存在。在小鼠ICC和人ICC和CCA的CellPhoneDB配体-受体分析中，myCAF和iCAF与肿瘤细胞都具有强烈相互作用。
ICC中的CAF亚群以及他们的受体-配体相互作用
接下来首先将I型胶原作为ICC中myCAF调节肿瘤生长的候选介质。与静息HSC相比，Col1a1在鼠和人ICC的CAF中强烈上调，scRNA-seq和CellPhoneDB分析表明Col1a1在myCAF中富集，而其同源受体DDR1在肿瘤细胞中表达，这表明COL1A1-DDR1是myCAF与肿瘤细胞之间除了胶原蛋白介导的机械敏感信号以外的联系。然而，在ICC模型的HSC-CAF中敲除Col1a1，尽管刚性和机械敏感信号降低，但并未抑制肿瘤的生长，敲除胶原受体编码基因Ddr1也是同样的结果。以上表明，COL1A1和DDR1都不是ICC增长所必需的。
Col1a1影响肿瘤刚性但不影响ICC的肿瘤生长
4.肌成纤维细胞CAF(myCAF)通过透明质酸合酶2促进肿瘤生长
接下来进一步研究了不依赖COL1A1通路的myCAF促进肿瘤生长的机制。着眼于myCAF中差异表达的基质基因，确定了透明质酸合酶2(Has2)是myCAF中上调最多的基因之一，CellPhoneDB分析显示，在各种细胞类型上有多种HA受体。与CAF中Has2mRNA的高诱导相似，透明质酸(HA)在两个ICC模型均很丰富，并且在HSC-CAF耗竭后大量减少。与CAF耗竭小鼠一致，Has2敲除的肿瘤显示出肿瘤细胞增殖显着降低。此外，在肝细胞/肿瘤细胞区室敲除被广泛认为是HA主要受体的Cd44并没有减少ICC的发展。结合CellPhoneDB分析表明，HAS2通过与CD44以外的非肿瘤细胞或受体相互作用介导其促肿瘤作用。
myCAF来源的HAS2介导促肿瘤作用
5.炎性CAF(iCAF)通过HGF-MET促进ICC
CellPhoneDB分析可以发现iCAF与肿瘤细胞具有强烈相互作用。为确定iCAF调控ICC生长的候选基因，分析了配体-受体相互作用的scRNA-seq数据，重点研究了差异表达的细胞因子和生长因子，发现了与肝脏再生和TME高度相关的肝细胞生长因子(HGF)-MET配体-受体对。与iCAF中Hgf的强表达互补，其受体Met在肿瘤细胞高表达，是将CAF直接关联到肿瘤细胞的候选配体-受体对。接下来，在ICC小鼠模型中敲除CAF中的Hgf，显示出ICC进展减少；敲除肝细胞/肿瘤区室中HGF的受体Met，发现ICC的生长显著降低。类似的，scRNA-seq证实了人ICC和CCA中iCAF的HGF高表达，MET在肿瘤细胞中表达，iCAF表达的HGF和肿瘤细胞的MET相互作用。这些发现表明，HGF-MET轴是关键的促肿瘤配体-受体对。
结论
该研究确定了ICC中CAF的来源和功能，并发现了不同的CAF亚群，这些CAF亚群可通过不同的介质促进ICC的生长。因此，CAF及其介质可作为ICC的治疗靶点。
参考文献
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